MLPA

• بررسی del/dup در ژنوم به ویژه: del/dup بزرگ با محدوده نامشخص del/dup در برگیرنده اگزونهای متعدد مانند بررسی ژن دیستروفین در افراد مشکوک به دیستروفی عضلانی دوشن (با این روش علاوه بر تشخیص بیماران، به سادگی می توان ناقلین را شناسایی کرد).

• بررسی تعداد نسخه ژنی در محل های خاصی در کروموزوم های مختلف جهت screening ژنهای مختلف.

• بررسی جهش های نقطه ای و پلی مورفیسم های (SNP’s) شناخته شده

• بررسی کمی mRNA

• بررسی وضعیت متیلاسیون مناطق پروموتری و یا imprinted

• بررسی DNA استخراج شده از بافت (paraffin imbedded یا formalin treated)

اساس این روش بر پایه هیبرید شدن هر جفت پروب با توالی مشخصی در ژنوم به صورت اختصاصی می باشد. به طوری که حتی تغییر یک نوکلئوتید در محل اتصال 2 پروب قابل شناسایی است و از این خصوصیت می توان برای طراحی پروب های اختصاصی جهت بررسی جهش های نقطه ای شناخته شده نیز استفاده نمود. حسن روش MLPA در آن است که می توان تعداد نسخه ژنی (deletion,duplication) با محدوده نامشخص را به راحتی و سریع مشخص کرد، در صورتیکه در روش Real-Time می بایست محل حذف و یا اضافه شدگی ها مشخص باشد. هر پروب MLPA از دو پروب الیگونوکلئوتیدی تشکیل شده است. اگر توالی هدف پروب در نمونه تست وجود داشته باشد هر دو پروب در کنار یکدیگر به نواحی اختصاصی هیبرید می شوند. درمرحله ی بعد پروب های هیبرید شده توسط یک لیگاز حساس به حرارت به یکدیگر متصل می شوند و در نهایت در مراحل بعد به روش PCR تکثیر می گردند، PCR در روش MLPA به علت وجود یک توالی برای پرایمر که در همه ی پروب ها یکسان است، بسیار با قدرت انجام می پذیرد. هر پروب MLPA یک محصول PCR با طول قطعه منحصر به فرد خود را دارد که این موضوع به علت وجود یک توالی Stuffer منحصر به فرد برای هر یک از پروب ها می باشد. در نهایت محصول PCR برای آنالیز به دستگاه ژنتیک آنالیزر منتقل می گردد و در نهایت الکتروفورگرام به صورت شکل زیر جهت آنالیز متخصصین ارائه می گردد.

همانطور که در شکل مشاهده می شود یک واکنش MLPA برای ژن های مختلف به صورت همزمان انجام شده و از طریق مقایسه ارتفاع پیک ها با نمونه کنترل آنالیز ها انجام می شود. MS-MLPA(Methilation Spesific-MLPA) در این روش تغییرات متیلاسیون علاوه بر تغییرات تعدادی در یک واکنش انجام می شود، کاربرد این روش در بیماری های با تغییرات اپی ژنتیکی و علامت گذاری ژنومی (Imprinting) می باشد، از جمله در مواردی مانند سندروم های پرادرویلی/آنجلمن و بک ویت وایدمن/راسل سیلور استفاده می شود. در این روش در صورت متیلاسیون نقطه موردنظر امکان برش آنزیمی وجود ندارد و در نهایت پروب ها به یکدیگر منتقل شده و محصول PCR وجود خواهد داشت.

امکان بررسی همزمان 40 تا 50 محل مختلف ژنومی در یک واکنش PCR نیاز به میزان کم DNA برای انجام این آزمایش نیاز به یک دستگاه ترموسایکلر و سیستم الکتروفورز کاپیلری (sequence type) می باشد. در صورت در دسترس نبودن سیستم الکتروفورز کاپیلری، محصول نهایی PCR را می توان در دمای 4 درجه نگهداری و به مراکز دیگر ارسال نمود. سرعت جوابدهی با توجه به حجم اطلاعات به دست آمده، بالا می باشد. به طوری که می توان طی 24 ساعت کلیه مراحل تا تفسیر را انجام داد. هزینه هر واکنش با توجه به حجم اطلاعات به دست آمده، بسیار مناسب می باشد. این روش از دقت و قدرت (robustness) بالایی برخوردار است. زیرا فقط از یک جفت پرایمر برای انجام تکثیر استفاده می شود و مشاهده سیگنال در هر محل، حاصل هیبرید شدن 2 پروب مستقل با ویژگی بالا در حد یک نوکلئوتید می باشد. روش کار یکسان برای کاربرد های گوناگون تمامی مواد لازم در یک کیت موجود می باشد. انجام همزمان QF-PCR و MLPA توجه به این ‌نکته لازم است که در حال حاضر اخذ مجوز ختم بارداری از طریق پزشکی قانونی تنها با در دست داشتن نتیجۀ QF-PCR میسر نیست، اما چنانچه نتیجۀ حاصله توسط تکنیک دیگری نظیر MLPA تأیید گردد، امکان ختم بارداری وجود خواهد داشت. ما این امکان را فراهم کرده‌ایم که با انجام تکنیک MLPA به طور همزمان باQF-PCR ، به فاصلۀ حدوداً ٣ روز پس از ارائۀ نمونه به آزمایشگاه، خانواده برای اخذ مجوز سقط جنین مبتلا به پزشکی قانونی ارجاع داده شود. توصیه: در شرایطی که زمان برای ختم بارداری واقعاً محدود باشد، توصیه می شود آزمایش QF-PCR و MLPA به ‌صورت همزمان با کشت کروموزومی درخواست شود. محدودیت آزمایش‌های QF-PCR و MLPA محدودیت آزمایش‌های QF-PCR و MLPAعدم قدرت تشخیص درجات پایین موزاییسم و همچنین عدم قدرت تشخیص اختلالات در کروموزوم‌های دیگر به غیر از کروموزوم‌های ١٣، ١٨، ٢١، X و Y است. مزایای آزمایش‌های QF-PCR و MLPA مزیت اصلی این آزمایش‌ها امکان جواب‌دهی در زمانی کوتاه است. همچنین برخورداری از حساسیت و اختصاصیت بالا و عدم تأثیرپذیری از سن بارداری نیز از جمله مزایای مهم این تکنیک محسوب می شود.