Real-time PCR
- خانه
- Real-time PCR
Real-time PCR تکنیکی برای مشاهده ی لحظه به لحظه فرايند تکثیر اسید نوکلئیک می باشد. مشکلات و نواقص عديده موجود در PCR های معمول، همراه با نياز به يک روش تعيين کمیِ دقيق، زمينه گشايش عرصه ای نوين در تکنيک PCR را فرآهم آورد. در این تکنیک از رنگهایی استفاده می شود که پس از اتصال به ساختار دو رشته ای DNA ، نور فلورسانس منتشر می کنند.
بنابراین در طی واکنش PCR، به موازات افزایش غلظت DNA، میزان ثبت جذب فلورسانس در واکنش توسط شناساگر دستگاه افزایش می یابد. با اندازه گیری شدت نور فلورسانس در انتهای هر سیکل، نهایتا یک منحنی بدست می آید. سپس با استفاده از نمودارهای استاندارد، غلظت DNA هدف در نمونه مورد مطالعه محاسبه می شوند.
مولکول های گزارشگرِ فلوروسنت یا به صورت رنگ هایی می باشند که به DNA دو رشته ای متصل می شوند، مانند SYBR® Green و یا بصورت شناساگرهای توالی های خاص مانند TaqMan® Probes می باشند.
به طور کلی Real timePCRچند مرحله دارد:
فاز اول The baseline region ; با وجود اینکه محصول دو رشته ای وجود دارد ولی نور آن قابل ردیابی نیست.
فاز دوم The exponential phase ; محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود و رشد نمایی مربوط به واکنش شروع می شود.
فاز سوم The liner phase; ترکیبات واکنش روبه اتمام است و کارایی آنها کم شده.
فاز چهارم The plateau phase; ترکیبات واکنش از بین می روند و افزایش در میزان فلورسنت مشاهده نمی شود.
مراحل ازمایشگاهی PCR
واسرشت سازی دو رشته DNA : دراین مرحله DNA دو رشته ای در درجه حرارت بالا(حدود 95 درجه) به منظور به دست آوردن مولکول های DNA تک رشته ای, واسرشت می شود.
هیبریداسیون: در این مرحله توسط پرایمر های الیگونوکلئوتیدی که مکمل توالی DNA تک رشته ای شده هدف می باشند در درجه حرارت حدود 40 تا 65 درجه هیبریداسیون صورت می گیرد.
طویل سازی(بسط یا سنتز): در این مرحله با یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند Taq پلیمراز در درجه حرارت حدود 72 درجه سانتی گراد طویل سازی رشته صورت می پذیرد.
این مراحل پی درپی تکرار می شوند به طوری که تعداد قطعات DNA در هر سیکل دو برابر می شوند.به قطعاتی که در هر سیکل به صورت تصاعدی افزایش می یابند آمپلیکون(Amplicon) می گویند.
مراحل نموداری PCR
در هر نمودار PCR سه مرحله قابل تشخیص است:
مرحله نمایی (صعودی): در هر سیکل در این مرحله محصولات مضاعف می شوند.
مرحله خطی: در این مرحله اجزای واکنش در حال مصرف شدن می باشند و واکنش به کندی پیش می رود و طول تولیدات در حال کاهش می باشند.
مرحله پلاتئو: واکنش متوقف شده است بیشتر محصولات ساخته نشده اند و تولیدات PCR رو به تنزل می باشند.
گروه ژنتیک کدون توانایی طراحی پرایمر برای Real-Time PCR و همچنین اجرای تمامی مراحل آزمایشات Real-Time برای بررسی بیماری ها و مباحث تحقیقاتی را با دستگاه های Step one plus، 7500 ABI و 7900 ABI Laser base را دارد.
