طراحی پرایمر

• Sequencing

• RFLP-PCR

• ARMS-PCR

در حال‌ حاضر پرایمر بیش‌ از هر عامل‌ دیگری عامل‌ موفقیت‌ یا شکست‌ در یک واکنش‌PCR است. برای طراحی پرایمر مناسب ملزم به رعایت نکاتی هستیم از جمله:

1. طول پرایمر:
   به طور معمول، طول ۲۲-۱۸ نوکلئوتید برای یک پرایمر بهینه است.

   نکته: اگر طول پرایمر کمتر باشد، احتمال اتصال غیر اختصاصی بالا می رود و اگر از این محدوده بیشتر باشد، اتصال پرایمر به الگو در دمای Anealing سخت تر می شود.

2. دمای ذوب پرایمرها:
   دمای ذوب پرایمرها یا به اصطلاح Tm، دمایی است که نیمی از DNA دو رشته ای از هم جدا می شود و DNA تک رشته ای ایجاد می کند.

   نکته : پرایمرهایی با Tm 58-52 درجه ی سانتی گراد معمولا بهترین نتایج را به دست می دهند.

3. دمای اتصال(Anealing) پرایمرها:
   دمای ذوب پرایمرها تخمینی از میزان پایداری هیبرید DNA-DNA است و در تعیین دمای اتصال خیلی اهمیت دارد. اگر دمای اتصال (Ta) خیلی بالا باشد، پرایمرها و الگو از هم جدا باقی می مانند و اتصال صورت نمی گیرد و اگر دمای اتصال خیلی پایین باشد تنها برخی از نوکلئوتیدهای پرایمرها به الگو متصل می شود و اتصال درستی رخ نمی دهد و محصولات غیر اختصاصی تولید می شود. از فرمول Rychlik برای به دست آوردن Ta استفاده می شود:
   -14.9(Ta= 0.3×Tm(primer)+ 0.7×Tm(product

4. محتوای GC:
   نسبت بازهای GC به کل بازها باید بین ۶۰-۴۰ درصد باشد.

5. گیره GC یا (GC clamp):
   وجود بازهای GC در پنج باز انتهای ‘۳ پرایمرها که به آن گیره GC گفته می شود اتصال اختصاصی در انتهای ‘۳ را بهبود می بخشد (به علت اتصال قوی تر بازهای G و C)

   نکته: در ۵ باز انتهایی سمت ‘۳ نباید بیش از سه G یا C قرار داشته باشد.

6. ساختار ثانویه پرایمر:
   حضور ساختارهای ثانویه ای که تحت تاثیر برهم کنش های بین مولکولی یا درون مولکولی ایجاد می شوند، منجر به تولید محصول بسیار ناچیز PCR می شود و یا اصلا محصولی تولید نمی شود. وجود این ساختارهای ثانویه برخلاف اتصال پرایمرها به الگو و تکثیر عمل می کنند. این ساختارها به میزان قابل توجهی دسترسی به پرایمرها را کاهش می دهند.

   نکته: پرایمرها باید برای ناحیه ای طراحی شوند که آن ناحیه ساختار ثانویه پایداری تشکیل ندهد. در غیر این صورت این ساختارهای ثانویه ی پایدار اجازه اتصال پرایمرها به الگو را نمی دهند.

7. ساختارهای سنجاق سری(hairpins) :
   این ساختارها جزء برهم کنش های درون مولکولی پرایمرها هستند و باید از آن ها دوری شود. انرژی آزاد گیبس (ΔG) انتهای ‘۳ پرایمر هرچه منفی تر باشد، ساختار پایدارتر است.

8. از همولوژی متقابل دوری کنید:
   برای بالا بردن اختصاصیت پرایمرها باید از نواحی همولوگ دوری کرد. به عبارت ساده تر، پرایمرها باید به گونه ای طراحی شوند که نواحی دیگر ژنومی را نشناسند و آن ها را تکثیر نکنند. با BLAST کردن پرایمرها این ویژگی بررسی می شود.

9. طول قطعه تکثیر شونده:
   طول قطعه تکثیر شونده در qPCR نزدیک به ۱۰۰جفت باز و در PCR استاندارد نزدیک به ۵۰۰ جفت باز است. اگر جایگاه قرارگیری پرایمرها بر روی الگو را بدانید، طول محصول از فرمول زیر به دست می آید: طول محصول= (جایگاه پرایمر جلویی- جایگاه پرایمر عقبی)+۱

10. دمای ذوب جفت پرایمرها:
    یک جفت پرایمر(عقبی و جلویی) باید Tm نزدیک به هم داشته باشند تا بهترین کارایی را داشته باشند. اختلاف ۵ درجه سانتی گراد یا بیشتر مانع تکثیر می شود.